消化時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞膜蛋白的改變，最直觀的表現(xiàn)就是消化后第二天漂浮細(xì)胞很多或者貼壁慢。

建議二次消化。細(xì)胞與細(xì)胞間的連接沒有通過酶切開的話，用移液槍進行吹散后細(xì)胞會被撕裂，直接導(dǎo)致細(xì)胞不貼壁甚至死亡。

懸浮細(xì)胞聚團，要分情況進行處理：

? 原本就是聚團生長的細(xì)胞，不用干預(yù)，比如NK-92等就是聚團生長；

? 如果是非聚團生長的細(xì)胞，比如THP-1聚團了，要區(qū)分高密度和低密度。高密度可以輕輕吹散細(xì)胞后進行低速離心，去除里面夾雜的死細(xì)胞，正常傳代即可改善；

? 非聚團生長的細(xì)胞低密度時，聚團一般是細(xì)胞狀態(tài)不太好，需要調(diào)整狀態(tài)。排查是否有污染以及培養(yǎng)環(huán)境合不合適等問題，對癥改善后細(xì)胞即可正常生長，聚團改善；

? 剛復(fù)蘇的懸浮細(xì)胞也會出現(xiàn)聚團，一般是靜置培養(yǎng)和少動，期間可以用補液和半換液的方式培養(yǎng)，等細(xì)胞密度長起來，生長至對數(shù)生長期時，團塊問題也會改善。

這個情況比較符合血清沉淀或者細(xì)胞碎片分泌物之類的，一般不用過于關(guān)注，細(xì)胞能夠茁壯生長就可以了。

如果是豬的肺組織提取的原代巨噬細(xì)胞，一般是終末分化的細(xì)胞，是不能增殖的，只能轉(zhuǎn)移到孔板做實驗。

一般要做分泌蛋白都是不建議加血清的。血清里面可能有一些蛋白類未知成分，不排除會和實驗的目標(biāo)蛋白有反應(yīng)或者類似，所以通常都是用的無血清。

原代組織分離后體外培養(yǎng)通常會有類似的問題，需要選擇合適的包被試劑進行輔助貼壁，這是原代提取比較常見的操作。

首先是細(xì)胞消化后盡量成單顆，鋪板的時候需要練習(xí)下手法，不要有旋渦產(chǎn)生，導(dǎo)致分布不均勻；除開鋪板手法外，細(xì)胞本身特性導(dǎo)致的容易聚團生長，可以嘗試包被培養(yǎng)瓶以后低密度接種細(xì)胞，可能會達到比較好的單層貼壁的情況。

胰蛋白酶屬于酶制品，受溫度影響，反復(fù)的4℃- 37℃的溫度波動反而會導(dǎo)致酶失活，效果不好，所以不建議37℃復(fù)溫。4℃拿出來可以直接用，加入到細(xì)胞消化的時候放進培養(yǎng)箱就好了。

這種情況一般還是消化不充分導(dǎo)致，建議可以適當(dāng)延長消化時間，待細(xì)胞與細(xì)胞間的連接打開后再進行吹散，一般是很容易吹散的。