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直播答疑 | 懸浮細胞培養(yǎng)要點解析

更新時間:2023-11-28  |  點擊率:1211


11月16日,普諾賽直播間為大家介紹了懸浮細胞的生長特點、培養(yǎng)注意事項,并通過THP-1、NK-92、NCI-H209三個細胞案例,深入講解了懸浮細胞的培養(yǎng)要點。直播回放可移步至B站-“普諾賽生物"進行觀看。本期直播答疑,從直播間提問中,篩選出部分有代表性的問題,做了詳細解答。


如有其他問題,也歡迎大家在推文底部留言,我們將在線解答。



Q1

傳代時,細胞密度比較低,但是培養(yǎng)基又

變黃了,怎么辦?

細胞培養(yǎng)過程中,如發(fā)現(xiàn)細胞量較少,但培養(yǎng)基變黃較快,可以從以下3個方面進行排查:


? 檢查培養(yǎng)基成分是否正常,如NaHCO3濃度是否偏低;


? 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度是否過高,一般培養(yǎng)基添加濃度為1.5g/L或2.2g/L的NaHCO3,使用5% CO2進行平衡;添加濃度為3.7g/L的NaHCO3可使用10% CO2進行平衡;


? 是否存在某種污染物,與細胞競爭營養(yǎng),導致培養(yǎng)基快速消耗。一般先排除細菌和真菌污染,通過培養(yǎng)法檢查即可(不加抗生素培養(yǎng)檢查),如排除細菌和真菌污染,可進行支原體檢測,確定是否存在支原體污染。

Q2

半換液算傳代嗎?怎么計算代數(shù)?

對于有限傳代的細胞,細胞的代次可以用以下公式進行計算

PDL =X+3.322(log Y – log I) 

其中X為傳代前代次 ; I 為細胞接種前細胞數(shù);Y 為培養(yǎng)后細胞總數(shù)


對于腫瘤細胞或無限傳代的細胞,傳代數(shù)僅僅代表操作的次數(shù),與傳代比例和細胞增殖數(shù)量沒有直接關系;


半量換液的細胞,如果沒有進行分瓶培養(yǎng),建議按照常規(guī)的換液來計算,不計入傳代次數(shù),如加入新鮮培養(yǎng)基后分瓶培養(yǎng),則可以將傳代數(shù)+1。

Q3

本來成團生長的細胞,不成團了怎么辦?

細胞是否成團生長,一般是跟細胞本身特性以及培養(yǎng)環(huán)境有關的。


如果是本來成團生長的細胞分散不成團,且增殖速度變慢,可能是細胞狀態(tài)變差的癥狀。一般可以從是否污染(特別注意支原體檢查)、細胞培養(yǎng)基或血清是否變更以及操作過程是否對細胞產(chǎn)生損傷這三個方面進行排查。


如果細胞僅僅是變成分散狀態(tài),但是生長指標都正常,則可能是由于培養(yǎng)條件或環(huán)境改變導致的,只要細胞生長正常且沒有其他異常癥狀,不需要過度關注。

Q4

懸浮細胞復蘇4-5天進行凍存會影響

細胞活率嗎?

細胞是否適合凍存取決于細胞的生長狀態(tài),用于凍存的細胞一般要求狀態(tài)良好,并處于快速增殖階段。


對于生長速度較快的懸浮細胞,4-5天可以傳代1-2次,狀態(tài)基本恢復,保證細胞處于生長旺盛的對數(shù)生長期即可凍存;


但是對于生長速度慢的細胞,4-5天細胞可能還處于狀態(tài)恢復中,沒有大量增殖,此時凍存可能會影響后續(xù)復蘇的狀態(tài)。建議復蘇后的細胞,培養(yǎng)1-2代,細胞狀態(tài)良好時進行凍存。

Q5

培養(yǎng)THP-1細胞兩周,培養(yǎng)液很容

黃,聚團很嚴重,中間有黑渣渣,怎么辦?

如果細胞量沒有明顯增加,培養(yǎng)基很容易變黃,黑點多且細胞聚團嚴重,懷疑細胞是存在某種污染,需要排除污染源后重新培養(yǎng)。

Q6

THP-1有少量貼壁細胞怎么處理?

如果出現(xiàn)少量貼壁,每次傳代培養(yǎng)時,只收集懸浮部分即可;如果需要完-全不貼壁,可以選擇低吸附的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。

Q7

培養(yǎng)幾天后,懸浮細胞的培養(yǎng)基是不是

會變渾濁些?

懸浮細胞和貼壁細胞不一樣,培養(yǎng)上清是略顯渾濁的,隨著細胞量的增加渾濁度也會增加。


可以通過鏡檢結(jié)果來與細菌等污染物進行區(qū)分,鏡檢細胞懸液,細胞間隙應該是干凈的,但污染的細胞間隙一般是大量黑色顆粒,有些可以觀察到明顯的運動。

Q8

THP -1細胞量挺多,但培養(yǎng)基長時間不

變黃,有什么辦法?

培養(yǎng)基是否變黃只是細胞傳代的參考指標。培養(yǎng)基變黃主要是細胞代謝產(chǎn)物積累導致,同時也會受到培養(yǎng)基的緩沖體系以及培養(yǎng)箱CO2濃度的影響。如果細胞生長正常,并且到了傳代的量,則可以正常傳代。


對于THP-1細胞來說,如果細胞數(shù)量足夠但是培養(yǎng)基不變黃,可能是由于細胞接種時培養(yǎng)基pH值偏高(可能是培養(yǎng)基開啟時間過長,CO2溢出導致的pH值升高),細胞數(shù)量雖多但沒有明顯代謝和增殖,所以顏色不容易變黃。所以建議不要直接分瓶,可以換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)觀察。

Q9

Sf9細胞靜置培養(yǎng)時正常,轉(zhuǎn)入搖瓶懸浮

培養(yǎng),停滯不長,但也沒死,是培養(yǎng)基不

適合懸浮培養(yǎng)嗎?

細胞培養(yǎng)條件的變更,如更換培養(yǎng)基,或者由靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)為搖瓶培養(yǎng),都需要一個馴化和適應的過程。


馴化過程,簡單說就是緩慢更換培養(yǎng)條件,如將新舊培養(yǎng)基按比例混合,讓細胞逐步適應,或者在搖瓶培養(yǎng)前期,調(diào)低搖床轉(zhuǎn)速,讓細胞逐漸適應。將細胞直接轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基或培養(yǎng)環(huán)境可能導致細胞不長甚至死亡的情況。



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